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红系发育进程对于机体的正常生命活动至关重要。目前，红细胞与其他血液制品主要来源于志愿者外周血捐献，供者不足、感染风险、稀有血型缺乏等仍是世界性的输血难题。 体外诱导多能干细胞定向分化为红细胞为解决上述问题提供了一条重要途径，但是多能干细胞分化来源的红系祖细胞脱核效率非常低，难以产生足够的成熟红细胞。 如何通过体外培养获得大量功能性的红细胞，是该领域的重要挑战。此外，红系发育异常与多种血液性疾病，如再生障碍性贫血（Aplastic anemia, AA）、地中海贫血（Thalassemia）、骨髓增殖性肿瘤 （Myeloproliferative Neoplasms, MPNs）等密切相关。 目前全球有超过一亿人患有红系紊乱性疾病，严重影响患者的生命健康与生活质量。人红系造血是一个多阶段的分化过程，造血干细胞（Hematopoietic stem cells，HSCs）首先向爆式红系集落形成单位（burst forming unit erythroid，BFU-E）分化，之后分化为红细胞集落形成单位（colony forming unit-erythrocyte，CFU-E），随后进入终末红系分化阶段，逐步分化为原红细胞、早幼红细胞、中幼红细胞和晚幼红细胞。 接着，晚幼红细胞排出细胞核生成网织红细胞与成熟红细胞。正常红细胞分化的各发育阶段均受到精确编排的特定基因表达谱所驱动。 基因表达谱紊乱可导致红系相关疾病，如真性红细胞增多症（polycythemia vera，PV）。该病是一种获得性克隆性干细胞疾病，95% 的 PV 患者存在 JAK2V617F突变，导致促红细胞生成素受体（Erythropoietin receptor，EPOR）信号通路组成性激活，引起下游一系列与细胞增殖，致使分化的基因表达紊乱，最终使红细胞增殖失控。 因此，研究红系发育稳态调节基因转录调控机制，对于体外高效扩增红细胞，解决血源紧缺世界难题及防治相关血液疾病具有重要的科学意义。 造血转录因子（Transcription Factors，TFs）直接与顺式调控元件结合，并同时招募转录辅助因子（cofactor），如 TATA 序列结合蛋白质相关因子 TAFs、Mediators、染色质重塑因子、组蛋白/蛋白修饰酶和支架蛋白等调控因子来精准地调控基因转录。 目前，少数 cofactors 被发现参与红系基因转录，如 FOG1、CBP / P300 和 LDB1。这些研究表明在红系发育过程中，cofactor 的正常表达水平与活性，对于红细胞发育过程中基因表达的精确调控至关重要，而 cofactor的失调已成为导致红系疾病的关键机制。 当下，已被发现的人红系分化关键cofactor 数量仍然较少。因此，继续深入发掘与探索红系分化过程中新的 cofactor 功能与机制，对于揭示红系发育的稳态调节机理、阐明红系紊乱性疾病转录水平发病机制，有着重要的基础理论与临床指导意义。 为了发现新的调控人红系发育的 cofactor，拓展红系发育基因转录调控理论，中南大学 Xu Han 教授和教授通过分析课题组前期测得的人红系发育转录组数据库，率先发现 Basic Helix-Loop-Helix（bHLH）蛋白超家族成员 HES6，在红系分化进程中表达明显增高，通过体外一系列实验发现 HES6 能显著调控红细胞发育。 HES6 是 HES/HEY 蛋白家族中的一个独特成员。与其他成员不同，HES6 被归类为转录辅助因子，因 HES6 的碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix，bHLH）结构域内的 loop 区比其他 HES 成员短 4 或 5 个氨基酸，因此不能通过自身的 bHLH 结构域结合 DNA，而是通过与其他 DNA 结合蛋白相互作用招募到 DNA 上。 HES6 已被证明可以控制小鼠 C2C12 成肌细胞的肌生成以及小鼠和爪蟾胚胎的神经发生。然而，在人红细胞中 HES6 及其互作的转录因子作用仍待揭示。 明确了 HES6 调控红系发育的生物学功能之后，他们利用 Flag-HA pull down 联合液相质谱、Co-IP 及 GST pull down 等技术，发现并证实HES6 是 GATA1 的重要 cofactor，并参与重要转录复合物 GATA1-FOG1-NuRD 的组成。 同时，该团队利用 RNA-seq 技术挖掘了 HES6与GATA1 的下游共调控靶基因。通过 DNA pull down、ChIP-PCR 与 ChIP-seq 等实验与生信分析技术，揭示了 HES6 通过 HES6-GATA1-STAT1 组成的正反馈转录调控环 路可以促进彼此的表达水平。 进一步地，他们还发现在红系分化进程中，促红细胞生成素（EPO）可促进该环路成员基因与蛋白表达，进而提示该环路是 EPO/EPOR-JAK2 下游一条重要响应通路。 通过 PV 临床数据分析他们发现该环路在真性红细胞增多症（PV）来源的 CD34+（伴有 JAK2V617F 突变）细胞中表达显著升高，敲低 HES6 与联用 STAT1 抑制剂 Fludarabine 可更有效抑制 PV 来源红细胞的异常增殖。 最后，他们在 PV 小鼠模型中利用骨髓造血重建技术，证实抑制 HES6 表达水平可显著降低 PV 相关病理特征。 基于此，该团队提出了如下结论：HES6 会以 GATA1 重要转录辅因子的身份，影响红系增殖、分化、脱核等生理进程，并参与 PV 红细胞异常增殖，因此它可被作为体外高效扩增红细胞、以及 PV 治疗的潜在靶点。 日前，相关论文以《新的 gata1 相互作用蛋白 HES6 是人类红细胞生成的重要转录辅助因子》（）为题发在
Nucleic Acids Research上[1]，中南大学博士是第一作者兼共同通讯，中南大学 Xu Han 教授和教授担任共同通讯作者。 图 | 相关论文（来源：
Nucleic Acids Research） 表示：“我们的工作首次阐明红系发育中 HES6 的表达特点和功能机制，发现 HES6 在调控人红细胞增殖与分化方面具有强大的生物学功能，而 HES6 功能的发挥离不开与其互作的转录复合物。” 图 | 王梓（来源：） 此外，本次研究结果支持 HES6 是治疗真性红细胞增多症的一个潜在靶点。对于将来的应用，他们认为可以进一步解析 HES6 蛋白晶体结构，并基于此开发抑制 HES6 活性的小分子抑制剂，降解 HES6 蛋白表达的 PROTAC 小分子化合物，或针对 HES6 与转录复合物互作结构域设计小分子多肽等，并有希望促进 HES6 靶 点由基础研究向临床应用转化。 在挖掘 HES6 时，他们利用了课题前期测得的人红系发育各阶段的转录组学数据。通过整体分析目前已知的 cofactors 转录水平, 发现相比其他 cofactors，HES6 在红系分化早期与终末期都维持着很高的表达水平。 之后结合本课题组之前建立的体外分离人 CD34+ 造血干细胞，并诱导其向红系分化的体系和各个阶段细胞检测方法，借此研究了 HES6 对红系增殖、分化的影响。 明确 HES6 为红系发育的关键 cofactor 之后，他们紧接着利用蛋白 pull down 与蛋白质谱技术，挖掘了 HES6 互作转录因子。 之后为了探索 HES6 调控红系分化的分子机制，他们利用 ChIP-seq 与 RNA-seq 研究了 HES6 的染色体占位与下游靶基因，并发现在基因组水平 HES6 可与 GATA1 共定位，且可以调控一系列 GATA1 下游靶基因与众多调控红系分化的信号通路。 接着，他们探索了 HES6 在红系分化过程中动态表达的转录调控机制，利用 ChIP-seq 数据分析、ChIP-PCR、DNA pull down 等一系列生信与分子生物学技术，他们发现 HES6、GATA1、STAT1 可组成一条正反馈调控环路，促进彼此表达水平。 随后为了探索 HES6 可否成为红系紊乱相关疾病的治疗靶点，他们分析了 HES6、GATA1、STAT1 在 PV 临床转录组数据库中的表达情况，结果发现该环路成员在人 PV 早期干/祖细胞中异常高表达，因此他们推测该环路的高表达潜在促进了干细胞偏向红系定向分化并促进细胞增殖。 利用病人来源的干细胞诱导红系分化模型，他们证实了抑制该环路表达与活性可显著抑制红细胞异常增殖能力。后又通过利用 PV 小鼠模型，他们在体内确证了抑制 HES6 可抑制小鼠红细胞增殖与分化能力，并显著降低 PV 相关病理特征。 表示：“本课题得到了如美国纽约血液中心教授、 教授等血液领域权威教授们的指导。为了课题推进，我们开展了多次线上会议。平日他们对我们的咨询都会第一时间解答，在论文撰写上也提供了很多修改建议。教授们对待科学的态度与精神让我们非常感动，值得我们敬佩与学习。” 而在本次研究中，尽管发现 HES6 可以参与 GATA1-NuRD 复合物的组成之中，但在分析 HES6 蛋白互作组学的过程中，他们其实还发现了其他潜在与 HES6 结合的转录因子，并且在分析 H ES6 全基因组的富集区域时，HES6 在基因组 DNA 上的富集峰要多于 GATA1 的富集峰，这提示 HES6 作为 cofactor 很可能不仅仅参与了 GATA1-NuRD 一种复合物。 因此，他们计划通过联合运用多组学技术比如定量蛋白组学、ATAC 组学、Hi-C 技术、代谢组学等技术，整体性地探索与 HES6 互作的转录复合物，并构建受 HES6 影响的基因-染色质-蛋白-代谢表型的分子调控网络，从而进一步深入挖掘 HES6 的分子调控机理。 参考资料： 1.Wang, Z., Wang, P., Zhang, J., Gong, H., Zhang, X., Song, J., ... & Liu, J. (2023). The novel GATA1-interacting protein HES6 is an essential transcriptional cofactor for human erythropoiesis.
Nucleic Acids Research, gkad167. 运营/排版：何晨龙
